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牧场大罐奶奶样细菌分离培养的应用

采用连续培养大罐奶奶样(BTM)的方法对牛奶质量进行监测,被越来越多的牧场接受,事实证明该方法对牧场生产非常有益。然而,能正确利用大罐奶奶样细菌培养技术的实验室很少,更多是滥用和误用。多数情况下检测操作和培养方法未被科学执行或评估。同时,检测结果的分析判定也需要操作者对检测方法充分了解。

尽管存在上述限制条件,许多牧场仍成功地将大罐奶奶样培养方法(BTM)应用于牛奶质量监测。前提是他们充分认识BTM的限制条件,并合理地应用了这项监测工具。



采样频次


关于BTM监测,最常遇到的问题是“多久进行一次采样检测?”。BTM的采样频次应该越勤越好,尽可能多的样本采集,获得的信息对牧场操作者来说更有用。理想状态是对每个奶罐均进行采样,但这种采样方式是不切实际的。但有一种采样方式将BTM采样与每周,每两周或每个月一次的牛群健康检查相结合。如每周采集BTM样本,冷冻保存样品直至做牛群健康检查的相关人员到来。这样就可以将BTM培养与整体的牛群健康检查服务相结合。

实际生产中,比较常见的一个问题是当牧场出现牛奶质量问题时,生产者才采集一次大罐奶样品送去检测培养。这种情况下,对检测结果的分析判定需要格外谨慎。即使牧场迫于牛奶质量评级被降低的问题,可能会持续送检一段时间。连续几天或几周的样本采集会更加实用,并能够帮助生产者更清晰地揭示出牧场中现阶段出现的问题。此外还可通过结合包括个体牛体细胞计数,挤奶机系统和挤奶程序评估分析等,帮助找出降低牛奶质量问题的真正原因以便针对性改善。






采样操作方法

大罐奶奶样培养没有行业标准,下述操作方法可帮助操作者在实验室内进行成功培养。

1. 样本采集十分重要。采样前应在大罐内搅拌牛奶5分钟。使用干净无菌的取样器,采集大罐上部的奶样(切不可从奶罐出口处采样)。然后立即将奶样放于冰上或者冰箱内冷藏,直到进行接种前。

2. 样本划线接种。取0.01毫升奶样于一块琼脂板中央,用同一根接种环蘸取琼脂板中央的奶样用合适的角度前后划线,直至奶样划线均匀铺满整个琼脂板表面。

3. 分别将样本接种于含5%牛全血的姨蛋白胨大豆琼脂培养基,含0.1%TBA的麦康凯琼脂(MAC),TKT琼脂,及甘露醇盐琼脂(MSA)或者葡萄球菌培养基110(SM)中,均一式两份。

4. 将培养皿置于37℃培养箱内培养48小时。

5. 结束培养,计数每个样本在两块同类培养皿中的菌落数量,并求平均值。其中TBA琼脂培养皿中生长的菌落数记为菌落总数(CFU/mL),麦康凯培养基中生长的菌落数为革兰氏阴性菌数;麦康凯培养基中生长的菌落数为大肠杆菌数;TKT培养基中生长的为链球菌数,在甘露醇盐琼脂中或葡萄球菌培养基中生长的为葡萄球菌数。

6. 若疑似金黄色葡萄球菌,需通过试管凝固酶试验或抗原A凝集因子乳胶凝集试验进行验证。若疑似无乳链球菌,需通过CAMP反应或兰斯菲尔德B组乳胶凝集反应进行确诊。
BTM检测的结果为半定量测量结果。选用的培养皿种类越多、培养皿选择性更丰富,所得的检测结果更准确。






结果

大罐奶培养出的细菌通常是混合菌群。理论上而言,任何从大罐奶培养中获得的细菌均有可能是造成乳区感染的病原,但真正找出因为乳区感染出现的病原菌仍然需要根据病原菌本身特点。大罐奶培养首要功能是用于检测牛群中是否存在传染性病原菌如金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。这些病原在大罐奶中的存在通常意味着牛群中存在感染乳区。下述为常见的大罐奶细菌培养结果特点的总结。
 

无乳链球菌

无乳链球菌在牧场中的唯一感染源就是感染的乳腺组织。大罐奶培养中检出无乳链球菌有且仅可能来自受感染的乳区中所产的牛奶。无乳链球菌感染会显著升高大罐奶培养的标准平板总菌落计数(SPC)和体细胞计数(SCC)。来自于无乳链球菌牛群的大罐奶总菌落数通常很高,在20,000至100,000 CFU/毫升,有可能会更高,因为奶牛通过牛奶释放细菌。对这个病原菌行之有效的乳房炎防控方案是,加强乳头药浴管理和牛群干奶牛治疗方案,若保持牛群封闭状态,可在2-3年内清除牛群中的无乳链球菌。清除牛群中无乳链球菌是完全可行的。
 

金黄色葡萄球菌

与无乳链球群不同,感染金黄色葡萄球菌的乳区通常仅释放少量的病原菌。因此在大罐奶培养中鲜少发生总菌落数升高现象。但是,对于金葡菌感染牛群中,在不存在无乳链球菌的情况下,大罐奶培养中获得的金黄色葡萄球菌数与大罐奶体细胞数间存在很大的相关性。导致大罐奶培养中金黄色葡萄球菌存在的原因与无乳链球菌存在的原因一致。坚持采用有效的乳房炎控制方案可在一个牛群水平中将总体金葡菌感染乳区降低至1%,大罐奶培养结果可实现目标为<50 CFU/毫升。
 

其他葡萄球菌属

其他葡萄球菌属(除金黄色葡萄球菌外的其他葡萄球菌)是乳头皮肤上的常在菌,在乳腺中分离获得十分常见。在大罐奶培养中葡萄球菌属计数过高,意味着挤奶前的乳区卫生准备和乳头消毒做的不好。该类细菌导致的乳房内感染通常仅造成乳区体细胞计数的轻微升高(<300,000细胞/毫升)。可造成标准平板的总菌落数升高,发生原因是挤奶设备的清洗不到位。大罐奶细菌培养葡萄球菌属计数的可接受目标是<1,000 CFU/毫升。
 

环境链球菌及大肠杆菌

若培养获得结果显示存在大量的环境链球菌和大肠杆菌,意味着在设备清洗消毒,挤奶过程中以及挤奶间隔期间卫生管理很糟糕。这两类细菌均来源于卧床,土壤,粪便和水。挤奶时乳区未擦干,挤奶管道有机物污染,垫圈及奶衬破损,清洗水温不够,牛奶冷却不当以及乳区感染均会导致大罐奶培养时环境链球菌和大肠杆菌数升高。同理若大罐奶培养时这些细菌计数下降通常说明环境卫生得到了改善。环境因素引起的大罐奶菌落数的增加通常也意味着乳房感染发生可能性的升高。由环境链球菌和大肠杆菌引起的临床乳房炎发病率与卧床中细菌数量和大罐奶细菌总数间存在明显正相关,该相关性在一项统计了9个管理良好的牧场的研究试验中被证实。对于环境链球菌和大肠杆菌的大罐奶培养计数的可行目标分别为<1,000 CFU/毫升及<500 CFU/毫升。






如何解释大罐奶细菌培养结果


进行大罐奶培养能回答的首要问题是,该奶样是否是金黄色葡萄球菌或无乳链球菌阳性。培养结果显示任何一种传染性病原阳性,则意味着牛群中至少有一头牛的一个乳区中存在该病原感染。然而,大罐奶培养结果不能用于定量预测该牛群中有多少乳区发生了感染。同时,阴性结果也并不能充分说明牛群中不存在这些病原感染。

BMT检测能回答的另一个问题是“本次检测样品中的优势菌群是什么?”。例如,如果在标准平板中无乳链球菌为优势菌群,则首要的改善措施为通过减少无乳链球菌感染率来提高大罐奶质量。同样,若培养结果显示大肠杆菌为优势菌群,则需要从别的方面寻找污染源。通常情况下,BMT检测结果中大肠杆菌数量很少(<500CFU/毫升)。
大肠杆菌数过高通常与挤奶设备清洗不当,挤奶操作不合理,牛奶冷却不充分以及乳区感染有关。大肠杆菌性乳区感染导致细菌总数升高不常见但会有发生。环境性链球菌亦相同。正确解读大罐奶培养结果需要了解这些菌属的生态学及造成大罐奶污染的来源。





总结


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